发现青霉素,偶然在必然中孕育回国后,弗莱明专心研究能杀死葡萄球菌的方法,以帮助伤员降低感染几率 。弗莱明有一个实验习惯,不论是哪种培养基,都会长久放置后,再进行观察,没有有用的发现后才去清洗干净 。
在培养一种新的黄色球菌的时候,弗莱明重感冒还未痊愈,打了个喷嚏,他突发奇想取了自己一滴鼻腔液放在了培养基上 。

两个星期后,弗莱明观察发现培养基上遍布球菌的克隆群落,鼻腔黏液所在位置却没有,而且其稍远位置有一种半透明的玻璃状新克隆群落 。但是进一步的研究发现,这其实只是细菌融化所致 。
1921年,弗莱明开始抗菌素的研究,实验结果表明鼻腔黏液中含有抗菌素 。他认为这种抗菌素是一种酶,而且几乎存在于人体的大部分体液和分泌物中 。
赖特建议把这种酶命名为“溶菌酶” 。
接下来的七年,弗莱明带领他的研究小组深入研究落菌酶的作用,但是收效甚微,他们失望地发现它的杀菌能力不强,对多种病原菌都没有作用,于是放弃了研究 。
1927年,弗莱明看到了一篇关于最新金葡菌(医院内导致交叉感染的主要致病菌)变异的研究文献,并产生了浓厚的兴趣,决定重复该实验 。
他在培养基边缘发现了一块因溶菌而显示的惨白色,这就是青霉素 。
实验表明,它的分泌物可以杀死某些葡萄球菌,这这些葡萄球菌容易引起创口感染 。

弗莱明将青霉素粗提物用在家兔和小白鼠身上,证实了他的结论 。弗莱明的追随者们,在一些深受感染危害的患者上使用过青霉素粗提物,并且取得了良好的效果 。
但是在大量实验过程中,弗莱明发现葡萄球菌遇到青霉素,会很快产生抗性 。而且在天竺鼠身上试验时,致死率非常高 。弗莱明不得不非常慎重使用青霉素 。粗提物成品里含有太多杂质,必须提纯后才能用于人员伤口治疗 。
由于当时的技术条件限制,弗莱明很难提取高纯度的青霉素,更别提应用于临床治疗,他最终放弃了青霉素的继续研究 。

研究重启,青霉素被认可和广泛应用青霉素的发现并未引起医学界的重视 。弗莱明发表了《关于霉菌培养的杀菌作用》论文后,将青霉素菌种移交给牛津研究小组后,其研究重心放在了其他方面 。
1932年,弗莱明所在医院的一位医生再次使用青霉素治疗眼疾成功时,他向当时的牛津小组领导弗洛里提起青霉素的重要作用时 。弗洛里不以为然,并没有重视 。青霉素就此尘封 。
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