茶多酚的离体抗氧化作用( 二 ) _茶叶技术

4.肝匀浆GSH耗竭与测定：小鼠脱颈椎致死，立即取出肝组织，以4℃生理盐水作5％(W/V)组织匀浆，取2 mL肝匀浆，加入一定量的茶多酚(TP)及生理盐水(NS)，见表3，每组重复7管。加入1 mmol/L VitC和50 μmol/L FeSO4各0.2 mL，37℃水浴孵育60 min，激发氧自由基致GSH耗竭［5］。后用2 mL 10％TCA沉淀蛋白，离心取上清0.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)2 mL及0.04％DTNB显色剂0.3 mL，混匀5 min后用722型分光光度计412 nm处测吸光值(A) 。
以1 mmol/L GSH用同法作标准曲线，将上述吸光值代入GSH标准曲线回归方程，求得组织GSH含量，单位以μmol/g湿重表示。
各项数据用平均数和标准差()表示，t检验判定两组间差异的显著性。
结果
(一)溶血试验：结果见表1 。
表1 TP拮抗UV致人血RBC溶血作用
Tab 1 Effect of TP on hemolysis degree induced by UV

TP n Absorbance
()
0 6 0.550±0.037
1.67 mg.mL-1 6 0.019±0.007*
3.33 mg.mL-1 6 0.011±0.002*

*P＜0.01, vs 0 group
实验得出，UV可致人血RBC溶血，茶多酚显著抑制UV致血RBC溶血作用，与对照组相比，差异十分显著(P＜0.01) 。
(二)质粒PUC19DNA单链断裂测定：质粒PUC19是双链环状DNA，2 686 bp 。双链环状DNA常呈超螺旋构象，若DNA单链断裂则转变为开环型质粒，若双链断裂则转变为线型质粒。 60Co γ射线照射可导致DNA链断裂。实验证明，低剂量(10～180 Gy)γ射线照射，导致部分DNA单链断裂，呈超螺旋和开环型质粒，未发现线型质粒；高剂量(例400 Gy)照射，则导致DNA双链断裂，全部转变为线型质粒。本实验采用100 Gy γ射线照射，部分超螺旋DNA由于单链断裂而转变为开环型，茶多酚抑制了受照开环型质粒百分率的升高，即抑制了受照质粒DNA单链断裂作用,与照射对照组相比,差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，结果见表2、图1 。
表2　60Co γ射线致质粒PUC19 DNA单链断裂的测定
Tab 2　Test of single-strain break of plasmid PUC19
induced by 60　Co γ-rays ()

Group n TP
(mg.mL-1) Supercoil
(%) Open coil
(％)
Control1 2 0 69.68±2.47 30.32±2.47
Control2 3 0 49.06±2.28 50.94±2.28
TP1 3 2.81 55.97±2.84* 44.03±2.84*
TP2 3 5.62 59.32±4.24* 40.68±4.24*
TP3 3 8.43 62.78±0.93** 37.12±0.93**

Control1：control and not irradiated; Control 2:control and irradiated
*P＜0.05,　**P＜0.01, vs control 2
Fig 1　Test of single-strain break of plasmid PUC19 induced by 60 Co γ－rays
A： Supercoil；B：Open coil
1： λDNA/Hind Ⅲ Markers； 2， 3： Control and not irradiated； 4，5，6： Control and irradiated； 7，8，9： TP1； 10，11，12： TP2；13，14，15： TP3
图1　60Co γ射线致质粒PUC19 DNA单链断裂的测定
(三)肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)耗竭与测定：对Vit C/Fe2+诱使的小鼠肝匀浆GSH耗竭，茶多酚有显著的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01) 。结果见表3：
表3　TP拮抗 Vit C/Fe2+致使小鼠肝匀浆GSH耗竭的测定
Tab 3　Test of TP inbibition the exhaustion of GSH levels of mice
liver homogenate　initiated by Vit C/Fe2+ (,n=7)

TP Absorbance(A) GSH(μmol.g-1)
0 0.164±0.025 7.96±0.23
0.45mg.mL-1 0.185±0.023* 9.12±0.12*
0.90mg.mL-1 0.229±0.030** 11.60±0.51**

*P＜0.05, **P＜0.01，　vs 0 group

讨论
溶血试验是检测生物抗氧化试验的常用方法之一。 UV照射RBC悬液，激发水产生.OH，.OH是目前已知的最强氧化剂［6］。 .OH攻击RBC膜上多不饱和脂肪酸导致脂质过氧化，致使膜通透性增加，血红蛋白渗出导致溶血。茶多酚显著抑制了UV导致的RBC溶血作用，说明茶多酚能抑制RBC膜的.OH的氧化损伤。

茶多酚的离体抗氧化作用( 二 )

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